對(duì)于“神秘”的5-hmC，目前還沒有一種測序方法能準(zhǔn)確判定它在基因組中的位置。為此，美國芝加哥大學(xué)與Pacific Biosciences公司的研究人員合作，利用第三代單分子SMRT測序技術(shù)和5-hmC的選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來高通量檢測5-hmC。通過聚合酶動(dòng)力學(xué)帶來的寶貴信息，研究人員可直接檢測DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。

 

甲基化研究如今開展得如火如荼。除了人們熟知的5-mC，很多研究人員也將目光轉(zhuǎn)向了另一種DNA修飾——5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）。5-hmC是5-mC的羥基化形式，1952年在噬菌體DNA中發(fā)現(xiàn)。幾十年來，羥甲基胞嘧啶的研究一直圍繞著它對(duì)于噬菌體DNA的保護(hù)作用。直到zui近，人們發(fā)現(xiàn)它與多個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞功能有關(guān)，包括胚胎干細(xì)胞發(fā)育、正常的骨髓細(xì)胞生成和受精卵發(fā)育。

 

若想深入了解5-hmC的生物學(xué)功能，必須開發(fā)出一種靈敏的測序方法，以揭示它在基因組中的位置。而現(xiàn)有的測序方法，如亞硫酸氫鹽測序，無法區(qū)分5-mC和5-hmC。為此，美國芝加哥大學(xué)與Pacific Biosciences公司的研究人員合作，利用第三代單分子測序技術(shù)和5-hmC的選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來高通量檢測5-hmC。該研究成果于11月20日發(fā)表在《Nature Methods》在線版上。

 

Pacific Biosciences公司開發(fā)的單分子實(shí)時(shí)（SMRT）DNA測序是一種第三代的測序技術(shù)，它利用單個(gè)DNA聚合酶分子來開展DNA合成，并監(jiān)控核苷酸的不斷摻入。核苷酸摻入的實(shí)時(shí)記錄，不僅產(chǎn)生了序列讀取，還帶來了關(guān)于聚合酶動(dòng)力學(xué)的寶貴信息。通過這些信息，研究人員能鑒別DNA堿基的修飾。

 

一般來說，聚合酶在修飾堿基周圍的速率要比未修飾DNA慢。通過比較每個(gè)模板位點(diǎn)的摻入時(shí)間、脈沖間持續(xù)時(shí)間（IPD），可定量比較這一差異。利用這一方法，研究人員可直接檢測DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。聚合酶動(dòng)力學(xué)的測定是SMRT測序的內(nèi)在組成，不會(huì)對(duì)DNA一級(jí)序列的測定有任何不良影響。

 

研究人員還對(duì)5-hmC進(jìn)行了選擇性化學(xué)標(biāo)記。首先利用β-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶為5-hmC引入疊氮修飾，之后通過點(diǎn)擊化學(xué)（click chemistry）反應(yīng)安裝一個(gè)生物素標(biāo)簽。通過這種方法，研究人員富集了基因組中的5-hmC，減少所需的測序量。此外，5-hmC上的大體積標(biāo)簽在SMRT測序中產(chǎn)生了更大的動(dòng)力學(xué)信號(hào)，以便在較低覆蓋度時(shí)更自信地修飾堿基。

 

為了檢驗(yàn)這種方法的可行性，研究人員檢測了小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）中的5-hmC。在選擇性標(biāo)記和富集之后，他們制備了SMRTbell DNA文庫，用于鳥槍法SMRT測序，并分析動(dòng)力學(xué)信號(hào)。他們檢測到清晰的HS-N3-5-gmC信號(hào)。由于動(dòng)力學(xué)信號(hào)的大幅增加，在單分子讀取中可輕松5-hmC的位點(diǎn)，而無需與未修飾的對(duì)照樣品進(jìn)行比較。

 

作者認(rèn)為，這種技術(shù)將是研究5-hmC生物學(xué)功能的有力方法。