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大鼠場景恐懼實驗方法點擊次數(shù)：3330 更新時間：2011-07-04

      

       場景恐懼（cued and contextual fear conditioning）是基于巴普洛夫條件反射而建立的。它測定動物學習、記憶不悅經(jīng)歷（aversive experience）和環(huán)境暗示之間關聯(lián)的能力。常用聲音或光暗示作為條件刺激（conditioning stimulus，CS），以厭惡性刺激（如足電擊）作為非條件刺激（unconditioned stimulus，US），二者配對出現(xiàn)。經(jīng)過這種CS-US訓練，動物不僅學會聲音和電擊之間存在，而且知道電擊和周圍環(huán)境之間也存在某種（context）。前者為聽覺暗示條件恐懼（auditory cue fear conditioning）或暗示條件恐懼（cued fear conditioning），后者為關聯(lián)條件恐懼（contextual fear conditioning）?？謶质欠庆`長類動物少有的幾種情感反應之一。動物經(jīng)歷條件恐懼后，當再次接觸條件刺激時，會產(chǎn)生一系列的生理反應，包括自主神經(jīng)緊張、應激激素分泌增加以及防御行為增多，等等。凝滯（freezing）即是動物防御行為的一種，是指動物除呼吸之外沒有任何其他活動，猶如在黑夜處于迎面而來的汽車強燈照射之下的驚鹿，一動不動。它被認為是評價嚙齒類動物恐懼的可靠指標。

參與條件關聯(lián)學習過程的腦部結構主要為杏仁核和海馬。前者調節(jié)恐懼，后者調節(jié)與恐懼性事物相關聯(lián)的學習認知。所以，這一模型主要用于杏仁核和海馬依賴的記憶。動物不需要禁水或禁食，且實驗設備較為簡單，訓練時間相對較短。因此，該模型廣泛用于轉基因小鼠敲除小鼠的行為表型研究。
  • 一、實驗設備
包括條件恐懼箱、隔音箱和關聯(lián)條件箱，由上海欣軟信息科技有限公司研發(fā)制作。條件恐懼箱包括與箱底格柵地板相聯(lián)的電擊發(fā)生器（可產(chǎn)生0.1~1.0mA的各種強度的電擊）、聲音發(fā)生器（可產(chǎn)生寬頻的卡嗒聲或低頻音），并與計算機相聯(lián)。隔音箱裝有一燈、一小風扇（用于通風和產(chǎn)生背景音）以及一個與聲音發(fā)生器相聯(lián)的擴音器。隔音箱門上有一貓眼，用于觀察操作箱內的動物。一個隔音箱內可放置兩個操作箱，這樣可同時觀測兩只動物，但兩動物彼此不能互相看見。關聯(lián)箱由透明有機玻璃制成，有可移動的格柵式地板和紗窗式頂部。為防止動物滑至格柵下面，格柵條之間距離應足夠短。對小鼠和年幼大鼠，關聯(lián)條件箱通常為26cm*21cm*10cm；格柵地板由不銹鋼條（直徑1.5mm，中央間距小鼠為0.5cm、年幼大鼠為1.2cm）組成。對成年大鼠，關聯(lián)箱通常為29cm*23.5cm*19.5cm，格柵地板包括16根不銹鋼條（直徑2.5cm、中央間距為1.25cm）。此外，還有電壓計和聲強計，用來檢測刺激強度。
  • 二、實驗方法
分為訓練和測試兩階段
（一）訓練階段（*天）
 
1．調試儀器，以確保格柵地板有電流刺激，擴音器有聲音刺激，并分別記錄電流強度和聲音強度（分貝）。
2．將大鼠放入條件恐懼箱2min（A相），記錄這zui初2min內動物的凝滯（freezing）時間作基線。
3．接著加入卡嗒聲，80Db,30s（B相）。
4．緊接著再給予電擊，0.35mA，2s（C相），完成一輪訓練。如需要多輪訓練，則重復A、B、C三相訓練即可。
5．記錄整個訓練階段動物凝滯時間（s），用以測量動物的非條件恐懼（unconditioned fear）。
6．將大鼠移開操作箱。用70%的酒精或4%醋酸溶液*清潔操作箱，以備進行下一批動物的訓練。
（二）測試階段 在訓練后的第二天進行，包括關聯(lián)（context）測試、變更關聯(lián)（altered context）或條件刺激前（pre-conditioning-stimulus，pre-CS）測試以及條件刺激（conditioning stimulus，CS）測試。測試階段沒有電擊刺激。關聯(lián)測試和變更關聯(lián)測試中也沒有聽覺條件刺激，但每只動物所用的操作箱應與訓練階段的相同。
1．關聯(lián)測試 將動物放入箱內，計算機自動記錄動物的凝滯行為。若用人工觀察，則觀察者（應不知道動物的處理或基因型）用靜聲秒表通過箱門上的貓眼（小窗口）觀察動物的行為并計分：凝滯為1分，活動（moving）為0分（也有只記錄凝滯時間）。每10秒觀察一次，共5min，這樣可記錄到30次（bout）可能的凝滯（即zui大凝滯得分為30分）。用在這一階段記錄到的、動物在同一操作箱內的凝滯時間測量動物的關聯(lián)條件恐懼（contextually conditioned fear）。此為關聯(lián)測試。觀察結束后將動物放回籠內，清潔操作箱，進行下一只動物的觀察。
2．變更關聯(lián)測試和聽覺條件刺激測試 關聯(lián)測試1h后進行。操作如下：
（1）將計算機調至所需程序。
（2）操作箱進行如下改造：1用平滑塑料板取代關聯(lián)條件箱內的格柵地板；2在箱的對角線加一塊有色塑料板，這樣將長方體的操作箱變成三角體；3改變嗅覺暗示（olfactory cues）。例如，可在箱的一角放一個裝有一滴桔子汁或檸檬汁的杯子，或直接將一滴果汁涂于墻上。然后開始變更關聯(lián)和聽覺條件刺激實驗。
（3）將動物放入經(jīng)改造后的關聯(lián)箱（從關聯(lián)實驗中的*只動物開始）。
（4）啟動預置的實驗程序，每隔10秒記錄動物的凝滯和非凝滯得分（分別為1和0分），共記錄3min，即18次可能的凝滯記錄（凝滯得分為18）。
（5）加入聽覺條件刺激30秒。重復上述記錄3分鐘。
（6）將動物放回籠子，清潔操作箱，進行下一只動物的測試。
  • 三、結果計算與分析
因為不同類型的學習凝滯時間不同，所以zui常使用百分計：
關聯(lián)=（關聯(lián)測試中的凝滯得分/30）*100%
變更關聯(lián)（條件刺激前）=（變更關聯(lián)中的凝滯得分/18）*100%
聽覺暗示（條件刺激）=（聽覺條件刺激中凝滯得分/18）*100%
對每一不同的凝滯測試計分進行重復測量單因素方差分析（ANOVA），從此比較關聯(lián)和變更關聯(lián)或聽覺暗示之間的條件恐懼程度，并確定組間差異。一般而言，動物在聽覺暗示中的凝滯行為要比關聯(lián)測試的多。在變更關聯(lián)測試中，由于關聯(lián)條件箱已被改造得“面目全非”，訓練時動物獲得的對周圍環(huán)境的關聯(lián)幾乎不存在，因此，凝滯行為應該zui少。關聯(lián)與變更關聯(lián)差別很大，凝滯計分差別越大。
如果動物在第二天的關聯(lián)測試和聽覺暗示測試中出現(xiàn)凝滯，而在變更關聯(lián)測試中不表現(xiàn)凝滯行為，則可認定：動物的感覺和運動功能均正常；能記住前一天與厭惡刺激配對出現(xiàn)的暗示信號；能分辨前一天不與厭惡刺激配對出現(xiàn)的暗示信號，說明動物具有正常的記憶。這些測試中的任何一項增強或減弱，提示調節(jié)記憶情感部分的神經(jīng)解剖、神經(jīng)遞質和基因可能發(fā)生變化。
電話：
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