細胞培養(yǎng)技術解答

一、細胞培養(yǎng)基礎問答

1.BHK細胞就是指BHK21嗎？

    答：BHK細胞是指幼年敘利亞地鼠腎細胞（Baby Hamster Syrian Kidney），1961年建株。原始的細胞株是成纖維細胞，貼壁依賴性。1963年獲得單細胞克隆細胞。后經(jīng)無數(shù)次傳代后細胞可懸浮生長，它廣泛用于增殖各種病毒，生產獸用疫苗。zui常用的是BHK21的一個亞克隆細胞，即克隆13或C13 。

2.二倍體細胞有什么特點？

   答：二倍體細胞的染色體組型是2n核型；貼壁依賴接觸抑制；一般可傳代50代；無致瘤性。如W1-38：正常胚肺組織人二倍體細胞系。MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細胞系。

3.什么是動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)？

    答：所謂動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設定pH、溫度、溶氧等），在細胞生物反應器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產生物制品的技術。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及人二倍體細胞、CHO（中華倉鼠卵巢）細胞、BHK-21、Vero細胞（非洲綠猴腎傳代細胞）等，并已成功生產了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產品。

    在過去幾十年來，細胞培養(yǎng)技術經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉瓶（roller bottle） 、CellCube等貼壁細胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應器（Bioreactor）進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)。

4.細胞體內外培養(yǎng)的差別是什么？

    答：細胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調節(jié)和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。因此，培養(yǎng)中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。

5.什么是無血清培養(yǎng)基？與普通培養(yǎng)基有什么區(qū)別？

    答：無血清培養(yǎng)基（serum free medium,SFM）:是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。添加組分可能包括纖連蛋白、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素、轉鐵蛋白、硒等。

6.什么是無血清無動物組分培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基和限定化學成分培養(yǎng)基？

    答：無血清無動物組分培養(yǎng)基是不含任何動物來源成份的無血清培養(yǎng)基，但可能添加植物蛋白或重組蛋白。無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有蛋白的培養(yǎng)基，無論是植物蛋白或動物蛋白。成分培養(yǎng)基（chemical defined medium,CDM）:是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有蛋白，也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結構與功能的小分子化合物，如短肽等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細胞的分泌產物和產品純化。

7.HEPES在細胞培養(yǎng)過程中起什么作用？

    答：HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。

8.CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

答：定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

二、 培養(yǎng)基生產和使用常見問題

1.低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎？

   答：低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同，不能通過肉眼觀察或通過經(jīng)驗來判定pH值，建議使用pH計進行測定。

2.低血清培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是什么？

   答：平衡鹽一般是由無機鹽及葡萄糖組成的。平衡鹽有Hanks′系統(tǒng)、Earle′s系統(tǒng)、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽系統(tǒng)等。199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有Hanks′系統(tǒng)的培養(yǎng)基及Earle′s系統(tǒng)的培養(yǎng)基。但是有些培養(yǎng)基均不是以上常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，例如RPMI 1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基。MEM（SLM）低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力。

3.谷氨酰胺溶液和碳酸氫鈉的配制方法是什么？

   答：以0.2mol/L的 L-谷氨酰胺配制為例：稱取L-谷氨酰胺2.92g，加注射用水100ml，充分攪拌混勻。用0.2μm濾膜正壓過濾除菌。溶液應在4℃下避光保存，2周內使用。以7.5% NaHCO3的配制為例：稱取NaHCO37.5g溶于100ml蒸餾水中過濾除菌。

4.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

   答：酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。酚紅本身對生物制品質量并不會產生影響，可以通過純化技術去除，但酚紅在無血清培養(yǎng)基可能帶來胞內鈉/鉀失衡，影響細胞生長，當然這種作用能被血清所中和或減輕。酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國外的疫苗或抗體生產企業(yè)在生產過程中都使用無酚紅培養(yǎng)基。

5.放置在冰箱中的培養(yǎng)基顏色會發(fā)生變化，為什么？

     答：培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中酸堿指示劑（通常為phenol red）的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿后再用于細胞培養(yǎng)將造成細胞生長停滯或死亡。培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾的CO2，以調整pH值。

6.無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？

    答：當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。因為血清中的蛋白會結合和滅活一些抗生素。而在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活。

7.培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

    答：一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

8.什么是個性化培養(yǎng)基？它有什么優(yōu)點？

    答：根據(jù)細胞類型、培養(yǎng)方式和生產工藝等特點所定制的培養(yǎng)基，即個性化培養(yǎng)基。個性化培養(yǎng)基在國外生物制藥企業(yè)被普遍采用，個性化培養(yǎng)基可以為細胞生長提供充足的營養(yǎng)物質，能提高細胞的生長速率、培養(yǎng)密度、以及延長細胞維持時間；也可以為細胞生長提供均衡的營養(yǎng)供給，減少細胞有害代謝物質的積累，降低對細胞生長的危害；同時對貼壁細胞而言，能增加細胞的貼壁性，并降低培養(yǎng)過程中剪切力對細胞的損傷；個性化培養(yǎng)基可以根據(jù)各戶的特殊需求減少或不使用動物源成分，從而使生物制品安全性更有保障。

9.細胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？

    答：如果細胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應該自然溶解培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

10.細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

    答：動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10%DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95%原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

11.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎？

    答：大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數(shù)過多會將使含有的蛋發(fā)生降解和沉淀，這將會影響它的性能。

12.液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？

    答：要冷藏！！通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個月到一年。

三、常見血清使用問題
1.血清使用時一定需要滅活么？

答：實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚至因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質量。

2.何謂FBS, FCS, CS, HS?

答：FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。

3.保存血清的方法是什么?

答：我們建議血清應保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇萜鲀?，再放回冷凍?/span>

4.如何解凍血清才不會使產品質量受損?

答：將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

5.血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?

    答：血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內一起過濾。不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。

6.如何避免血清中沉淀物的產生?

    答: （1）解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法（-20℃至4℃至室溫），若血清解凍時改變的溫度太大（如-20℃至37℃），非常容易產生沉淀物。

        （2）解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

        （3）請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分會因此受到損害，而影響血清的質量。

        （4）血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

        （5）若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

四、細胞培養(yǎng)常用試劑使用問答

1.谷氨酰胺使用方法是什么？

    答：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。

2.碳酸氫鈉在室溫條件存放是否穩(wěn)定？

答：碳酸氫鈉白色粉末，或不透明單斜晶系細微結晶。比重2.159。無臭、味咸，可溶于水，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微堿性，受熱易分解，在65℃以上迅速分解，在270℃時*失去二氧化碳，在干燥空氣中無變化，在潮濕空氣中緩慢分解。

3.培養(yǎng)細胞生長減慢的原因有哪些？其解決辦法有哪些？

    答：可能得原因有：更換了不同的培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子等耗盡或缺乏或已被破壞；培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染；試劑保存不當；比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗找出可能的原因。

        解決辦法：增加起始培養(yǎng)細胞濃度；讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)液；換入新鮮配制培養(yǎng)液；補加谷氨酰胺或生長因子等；用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5℃到-20℃；培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存；含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2 周內用完；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。

4.L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

    答：L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時非常重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，降解率隨保存溫度而變。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

5.細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？

    答：不見得！因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力zui強。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復沖洗細胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：

     （1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；

     （2）0.25% 胰蛋白酶

     多數(shù)細胞傳代消化可使用0.25％胰蛋白酶＋0.02％EDTA這種消化液。

6.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

    答：二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

7.GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

    答：GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解

8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

    答：丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.Hank′s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle′s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質的功能差別？

    答：HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagle′s （2.2g/L）中比在Hanks′ （0.35g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagle′s液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks′液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagle′s液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks′液就可以了。

五、細胞培養(yǎng)過程常見問題

1.為什么培養(yǎng)的細胞要及時傳代？

    答：體外培養(yǎng)的細胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當一個細胞被其他細胞包圍的時候，它就會停止生長，及時傳代后，細胞的生長得以繼續(xù)。

2.培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什么？

    答：通常細胞生長得非?？鞎r，pH值通常下降得很快。此時可以及時傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進行解決。此外，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細菌、酵母或真菌污染等也能導致pH值通常下降得很快。

       （1）按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對應CO2濃度為5％到10％。

       （2）改用不依賴CO2培養(yǎng)液。

       （3）松開瓶蓋1/4 圈。加HEPES 緩沖液至10 到25mM終濃度。

       （4）在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。

       （5）如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。

3.培養(yǎng)液pH對細胞生長的影響？

    答：由于大多數(shù)細胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對細胞生長將產生有害的影響。但各種細胞對pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細胞一般對pH變動耐受差，無限細胞系耐受力強。但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些。在配制培養(yǎng)用液時，需要注意一點：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。

4.購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？

    答：研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。但對于DMSO敏感的細胞，還是復蘇細胞時，用離心去除DMSO比較好。

5.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

    答：研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復雜，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳；血清使用錯誤或血清的品質不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸浮細胞誤認為死細胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；細胞置于–80 ℃太久等。建議嚴格參照ATCC或ECACC的標準操作規(guī)程進行細胞復蘇、凍存等工作。

6.支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？

    答：支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)、代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。

7.冷凍保存細胞之方法？

    答：冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃（30－60 分鐘）→-20℃（ 30 分鐘） → -80℃（16－18 小時或隔夜）→ 液氮罐長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3℃至–80 ℃以下， 再放入液氮中長期儲存。注意：-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

8.懸浮細胞應如何繼代處理？

    答：一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中，稀釋細胞濃度即可。若培養(yǎng)液太多時可分瓶取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

9.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

    答：欲回收動物細胞，其離心速率一般為300×g （約1,000rpm），5 - 10 分鐘，過高之轉速過長時間都將造成細胞死亡。合適的離心轉速是根據(jù)相對離心決定。 RCF=1.119×105×r×（rpm）2，其中 r為離心機轉軸中心與離心套管底部內壁的距離；rpm為離心機每分鐘的轉數(shù)；RCF（relative eentrifugal force）為相對離心力，以重力加速度g（980.66cm/s2）的倍數(shù)來表示表示單位。

10.培養(yǎng)細胞時應使用5%還是10%CO2，或者根本沒有影響？

    答：一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7g時，細胞培養(yǎng)時應使用10% CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應使用5%CO2培養(yǎng)細胞。

11.細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應馬上去除DMSO？

    答：除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

12.冷凍管應如何解凍？

    答：取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1－2 分鐘內大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺操作細胞，用75％消毒凍存管，用新鮮培養(yǎng)基將細胞轉移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。

13.如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞？

    答：將樣品適當稀釋后，用稀釋后的樣品和0.4％的臺盼蘭溶液按1:1混合后，用移液槍點樣到血球計數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)，其中藍色細胞是死細胞，因活細胞排斥臺盼蘭，不被染色。

14.細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

    答：冷凍管內細胞數(shù)目一般為1-8×106 cells/ml vial。

15.細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

    答：動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含9 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

16.如何消除組織培養(yǎng)的污染？

    答：當重要的培養(yǎng)細胞污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

　　高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1）在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。

2）分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3）每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2－3代。

5）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。

6）重復步驟4。

7）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染是否以已被消除。

17.培養(yǎng)細胞出現(xiàn)死亡其可能的原因有什么？解決辦法有哪些？

    答：可能的原因有培養(yǎng)箱內無CO2；培養(yǎng)箱內溫度波動太大；細胞凍存或復蘇過程中損傷；培養(yǎng)液滲透壓不正確；培養(yǎng)液種有毒代謝產物堆積等。解決辦法可以檢測培養(yǎng)箱內CO2濃度，檢查培養(yǎng)箱內溫度；取新的保存細胞種；檢測培養(yǎng)液滲透壓等；換入新鮮培養(yǎng)液等。

18.國內可以買到細胞株的地方有哪些？

答：可以從國內多家代理廠家買到ATCC或ECACC的細胞株，同時國內可以買到細胞株的地方還有中國醫(yī)學科學院（協(xié)和醫(yī)科大學）基礎醫(yī)學部，中國科學院細胞研究所以及武漢大學冷藏中心等。

19.細胞的滲透壓耐受性是多少？

    答：細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

20.支原體（mycoplasma） 污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？

    答：不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

21.怎樣查到一個特定細胞株的相關知識和培養(yǎng)條件？

    答：ATCC （American Type Culture Collection） 收集了絕大多數(shù)細胞的詳細資料。打開ATCC網(wǎng)頁的Cells and hybridomas鏈接，輸入細胞名稱就可以搜索ATCC的細胞數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫中有每一種細胞的詳細描述，包括細胞的來源，培養(yǎng)和凍存條件，以及相關文獻等資料。

22.為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

    答：胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。