白細(xì)胞介素-2（IL-2）生物學(xué)活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

1.  掌握IL-2生物學(xué)活性測(cè)定的原理。
　　2.  熟悉IL-2生物學(xué)活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)原理

IL-2是由Th細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，在淋巴細(xì)胞增殖分化過(guò)程中起到非常重要的作用。IL-2活性測(cè)定基于IL-2能維持IL-2依賴(lài)細(xì)胞的代謝和存活，促進(jìn)這類(lèi)細(xì)胞的增殖。細(xì)胞在增殖時(shí)能量代謝活躍，可產(chǎn)生大量的能量以供合成多種大分子物質(zhì)和細(xì)胞分裂所需，能量代謝的水平與細(xì)胞合成DNA水平基本平行，因此，測(cè)定細(xì)胞能量代謝的水平可以間接地反映細(xì)胞增殖情況。

MTT（四甲基偶氮唑鹽）是一種淡黃色的水溶性化合物，活細(xì)胞（特別是增殖期的細(xì)胞）通過(guò)線粒體能量代謝過(guò)程中的琥珀酸脫氫酶的作用，使淡黃色的MTT分解產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶狀甲臢沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周?chē)倚纬杉着N的量與細(xì)胞增殖程度呈正比，甲臢經(jīng)SDS作用后可溶解顯色。溶解液的光密度值與細(xì)胞代謝及IL-2活性正相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)材料

1.  1640培養(yǎng)液（*）、IL-2標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)IL-2樣品、CTLL-2細(xì)胞株、MTT溶液（5mg/ml）、10%SDS
　　2.  96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、多頭細(xì)胞收集器、微量加樣器、CO2孵箱、酶標(biāo)儀

實(shí)驗(yàn)方法

1.  制備CTLL-2細(xì)胞懸液  取生長(zhǎng)旺盛的CTLL-2細(xì)胞，用1640培養(yǎng)液將細(xì)胞洗3次，用*1640培養(yǎng)液配成2×105/ml細(xì)胞懸液。
　　2.  稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品  將待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)IL-2用*1640培養(yǎng)液做一定的倍比稀釋。
　　3.  加樣與檢測(cè)  向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入不同稀釋度的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品（50μl/孔），每稀釋度3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照。再向各孔加入50μl細(xì)胞懸液，混勻，置5%CO237℃培養(yǎng)36小時(shí)，每孔加入MTT溶液20μl CO2孵育6～8小時(shí)后，每孔再加10%SDS100μl，充分混勻，37℃孵箱靜放（使甲臢全溶解）。在酶聯(lián)儀上選波長(zhǎng)570nm測(cè)定OD值，將待測(cè)樣品的OD值與標(biāo)準(zhǔn)品OD值比較后，求得待測(cè)樣品的IL-2活性單位。

結(jié)果計(jì)算

將各稀釋度的OD值按照樣品zui大增殖OD值的百分比換算成概率單位，可將原來(lái)呈S形的曲線轉(zhuǎn)換成為直線。根據(jù)這些點(diǎn)的數(shù)據(jù)求出各直線的回歸方程。再?gòu)幕貧w方程求出各樣品達(dá)50%zui大增殖時(shí)的稀釋度，然后按公式求出待測(cè)樣品IL-2的活性單位。

注意事項(xiàng)

1.  MTT液要現(xiàn)配現(xiàn)用，避免光照，若有藍(lán)色顆粒需過(guò)濾后再用。
　　2.  生物學(xué)測(cè)定法敏感性高，特異性強(qiáng)，所測(cè)IL-2是具有生物活性的IL-2，而不象免疫學(xué)測(cè)定法所測(cè)定免疫反應(yīng)性IL-2蛋白，因此測(cè)定的條件和要求要嚴(yán)格按規(guī)程。