PCR反應(yīng)的zui大特點是具有較大擴增能力與*的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生.

一、污染原因

1、標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導(dǎo)致彼此間的污染.

2、PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.

3、PCR擴增產(chǎn)物污染.這是PCR反應(yīng)中zui主要zui常見的污染問題.因為PCR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性.

還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.

4、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見.因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力.其污染可能性也很大.

二、污染的監(jiān)測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.

對照試驗

1.陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志.陽性 對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽 性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）.但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽 性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照.

2.陰性對照:每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照.它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用 鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照.②試劑 對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染.

3.重復(fù)性試驗

4.選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增

三、防止污染的方法

1、污染的預(yù)防

進行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程，zui大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

（1）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)*閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：

a）標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備；

b）PCR擴增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴增；

c）產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

2、分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：

a）PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；

b）引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制；

c）引物和dNTP應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。

3、實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

（1）戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；

（2）使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

（3）避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

（4）操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的度；

（5）zui后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；

（6）操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；

（7）盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器zui容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；

（8）重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。

四、追蹤污染源

如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。

1、設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應(yīng)選擇擴增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照，100個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性*，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應(yīng)包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。

2、環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴密，則考慮可能為環(huán)境污染。

環(huán)境污染中常見的污染源主要有：

（1）模板提取時真空抽干裝置；

（2）凝膠電泳加樣器；

（3）電泳裝置；

（4）紫外分析儀；

（5）切膠用刀或手術(shù)刀片；

（6）離心機；

（7）冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等；

此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4）電泳檢測結(jié)果。

（8）氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時就應(yīng)該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設(shè)計新的引物（與原引物無相關(guān)性）。

五、污染處理

1、環(huán)境污染

（1）稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；

（2）紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照射時，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當(dāng)。如果這些位點（0.13/堿基）在DNA分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。

2、反應(yīng)液污染

可采用下列方法之一處理：

（1）DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA的序列；

（2）內(nèi)切酶法：選擇識別4個堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR；

（3）紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV照射法；

（4）g射線輻射法：1.5kGy的輻射可*破壞0.1ng基因組DNA，2.0 kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR，但高于此限度會使PCR擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。

3、尿嘧啶糖苷酶（UNG）法

由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。

（1）原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT。這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。

（2）dUTP法：用dUTP代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。

（3）dU引物法：合成引物時以dU 代dT，這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU。UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb以上）的擴增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。dU引物將dU設(shè)計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。

（4）優(yōu)點：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進行；由于擴增產(chǎn)物中有大量dU存在，可*消除污染源。

（5）需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響，在進行PCR產(chǎn)物克隆時，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG消化掉。

4、固相捕獲法

用于去除標本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：

（1）用一生物素標記的單鏈RNA探針與待擴核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴增區(qū)；

（2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產(chǎn)物和雜質(zhì)；

（3）洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA探針雜交區(qū)域。第（2）步的漂洗后可用PCR檢測以確定標本是否被擴增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。

5、RS-PCR法（RNA-specific PCR）

也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端（A區(qū)）有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個核苷酸（C區(qū)）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物（C）以*鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進行擴增加尾cDNA，而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會被擴增。

6、抗污染引物法

該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點被。如果重組質(zhì)粒污染了標本，也不能擴增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。