蛋白質(zhì)的沉淀方法及常見沉淀劑
蛋白質(zhì)沉淀的概念:
蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation),變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀,但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀,在一定條件下,變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。
定性分析:
蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有兩種穩(wěn)定因素,即顆粒表面的水化層和電荷。若無外加條件,不致互相凝集。然而除掉這兩個穩(wěn)定因素(如調(diào)節(jié)溶液pH至等電點和加入脫水劑)蛋白質(zhì)便容易凝集析出。如將蛋白質(zhì)溶液pH調(diào)節(jié)到等電點,蛋白質(zhì)分子呈等電狀態(tài),雖然分子間同性電荷相互排斥作用消失了。但是還有水化膜起保護作用,一般不致于發(fā)生凝聚作用,如果這時再加入某種脫水劑,除去蛋白質(zhì)分子的水化膜,則蛋白質(zhì)分子就會互相凝聚而析出沉淀;反之,若先使蛋白質(zhì)脫水,然后再調(diào)節(jié)pH到等電點,也同樣可使蛋白質(zhì)沉淀析出。
沉淀方法:
1.鹽析法——多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化
在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出,這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質(zhì)鹽析時所需的鹽濃度及pH不同,故可用于對混和蛋白質(zhì)組分的分離。例如用半飽和的硫酸銨來沉淀出血清中的球蛋白,飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來,鹽析沉淀的蛋白質(zhì),經(jīng)透析除鹽,仍保證蛋白質(zhì)的活性。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點后,再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好。鹽析法分為兩類,*類叫Ks分段鹽析法,在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現(xiàn),用于早期的粗提液;第二種叫b分段鹽析法,在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現(xiàn),用于后期進一步分離純化和結(jié)晶。影響鹽析的因素包括:蛋白質(zhì)濃度、離子強度和類型、PH值、溫度等。針對溫度這一條,需要強調(diào):在低離子強度或純水中,蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下,蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下,蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求,可在室溫下進行,只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。
使用硫酸銨沉淀蛋白需要注意:硫酸銨中常含有少量的重金屬離子,對蛋白質(zhì)巰基有敏感作用,使用前必須用H2S處理:將硫酸銨配成濃溶液,通入H2S飽和,放置過夜,用濾紙除去重金屬離子,濃縮結(jié)晶,100℃烘干后使用。另外,高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH。
2.有機溶劑沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化;
有機溶劑的沉淀機理是降低水的介電常數(shù),導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水,相互聚集,zui后析出。該法優(yōu)點在于:1)分辨能力比鹽析法高,即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀;2)沉淀不用脫鹽,過濾較為容易;3)在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。但是,在常溫下,有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此。因此,操作要求在低溫下進行。有機溶劑的選擇首先是能和水混溶,使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮,還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。
3.等電點沉淀法——此法單獨應(yīng)用較少,多與其它方法結(jié)合使用;
兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時溶解度zui低,不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點,以此為基礎(chǔ)可進行分離。如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時,在粗提液中先調(diào)PH8.0去除堿性蛋白質(zhì),再調(diào)PH3.0去除酸性蛋白質(zhì)。利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性,不然盲目使用十分危險。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后,等電點會發(fā)生偏移,故溶液中含有金屬離子時,必須注意調(diào)整PH值。等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用,以提高其沉淀能力。
附:沉淀血漿中各種溶劑以及去蛋白的效果<各種蛋白沉淀劑作用的比較>
名稱 | 上清液 | 0.5ml血漿中不同沉淀劑使蛋白沉淀的% | ||||||||
PH值 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | |
10%三氯醋酸 | 1.4-2.0 | 99.7 | 99.3 | 99.6 | 99.5 | 99.5 | 99.7 | 99.8 | 99.8 | 99.8 |
6%高氯酸 | <1.5 | 35.4 | 98.3 | 98.9 | 99.1 | 99.1 | 99.2 | 99.2 | 99.1 | 99.0 |
5%磷酸 | 1.6-2.7 | 39.8 | 95.7 | 98.1 | 98.3 | 98.3 | 98.5 | 98.4 | 98.2 | 98.1 |
乙腈 | 8.5-9.5 | 13.4 | 14.8 | 45.8 | 88.1 | 97.2 | 99.4 | 99.7 | 99.8 | 99.8 |
丙酮 | 9-10 | 1.5 | 7.4 | 33.6 | 71.0 | 96.2 | 99.1 | 99.4 | 99.2 | 99.1 |
甲醇 | 8.5-9.5 | 17.6 | 17.4 | 32.2 | 41.3 | 73.4 | 97.9 | 98.7 | 98.9 | 99.2 |
乙醇 | 9-10 | 10.1 | 11.4 | 41.7 | 74.8 | 91.4 | 96.3 | 98.3 | 99.1 | 99.3 |
Na2WO4-H2SO4 | 2.2-3.9 | 3.3 | 35.4 | 98.6 | 99.7 | 99.7 | 99.9 | 99.8 | 99.9 | 100 |
CuSO4-Na2WO4 | 5.7-7.2 | 36.5 | 56.1 | 78.1 | 87.1 | 97.5 | 99.8 | 99.9 | 100 | 100 |
ZnSO4-Ba(OH)2 | 6.6-8.3 | 45.6 | 80.7 | 93.5 | 89.2 | 93.3 | 97.0 | 99.3 | 99.6 | 99.8 |
(NH4)2SO4(飽和) | 7.0-7.7 | 21.3 | 24.0 | 41.0 | 47.4 | 53.4 | 73.2 | 98.3 | —— | —— |