原代細胞核膜的分離
試劑和器材:
1. DNA酶Ⅰ;
2. KCl(1mol/L溶于20mmol/L Tris-HCl,pH7.4);
3. MgCl2(1mol/L儲存液);
4. 苯甲基磺酰氟(PMSF)(無水乙醇配制的1mol/L儲存液);
5. 純化的細胞核;
6. 緩沖液:2mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
7. 膜懸浮緩沖液(ESB):0.25mol/L蔗糖、2mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
8. 梯度溶液:1.0mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2.0mol/L的蔗糖溶于2mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
9. 除了MgCl2外的所有溶液須含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟;
10. Abbé折光計;
11. 高速離心機,配有固定角轉子和離心管;
12. 超速離心機,配有固定角和吊桶式轉子、離心管;
13. 相差顯微鏡;
14. 紫外分光光度計(配石英比色皿);
實驗方法:
除特殊注明外,所有操作均在0—4℃下進行。
1. 將純化的原代細胞細胞核浸于緩沖液中孵育10min使之膨大去凝縮。之后約10000g離心10min,用緩沖液重懸沉淀,并重復這一步驟2次;
2. 用含DNA酶Ⅰ(0.01g/L)的緩沖液重懸凝膠樣溶脹的細胞核沉淀。充分混勻并室溫孵育30min,孵育的中途將上清調(diào)節(jié)至含約0.1mmol/L MgCl
2。隨著DNA被切割裂解,染色質(zhì)很快失去了凝膠狀特性。可通過相差顯微鏡檢測核膜“影子”的產(chǎn)生;
3. 采用固定角轉子或吊桶式轉子,約60000g離心30min;
4. 用緩沖液重懸核膜粗產(chǎn)物,并再次離心。重復這一步直至DNA釋放為止(即監(jiān)測上清在280nm下的吸光度,直至達到一很低平臺);
5. 選擇性地用KCl溶液洗滌獲得地核膜,以加速離子結合蛋白,尤其是組蛋白的去除。然后約60000g離心30min;
6. 將核膜用核膜懸浮緩沖液重懸,覆蓋配制的4個梯度溶液,置于吊桶式離心機中離心若干小時或過夜,以收集核膜等密度層;
7. 純化的核膜應該主要聚集在1.5mol/L與1.8mol/L兩蔗糖層的界面,用巴斯德吸管小心地從梯度液中移出核膜層;
8. 通過相差顯微鏡,或者通過瓊脂糖包埋進行負染和/或薄片電鏡,檢查核膜的完整性;
9. 對純化標本進行必須的生化分析,如SDS-PAGE或是酶學實驗;內(nèi)源性過氧化物酶是大鼠肝臟核膜的一個合適的標志,同時也存在Mg-ATP酶以及很多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶;