污染向來是在細(xì)胞培養(yǎng)中的大問題。預(yù)防或治理污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。我們在細(xì)胞培養(yǎng)時，在開始階段就要十分重視污染問題，否則會前功盡棄，這樣不僅浪費(fèi)時間，也會浪費(fèi)人力、物力。  

(一) 有哪幾類污染？

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染不只是指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì)，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。   

1、細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽ui常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，zui后變圓脫落死亡。   

2、真菌污染

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，zui常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。  

真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

3、支原體污染

支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的zui小微生物，zui小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。  

培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。   

4、病毒污染

組織細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。   

5、非同種細(xì)胞污染

由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。  

細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。

（二）污染類型的區(qū)別

1、細(xì)菌、真菌污染的檢測

     (1) 肉眼觀察----細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內(nèi)可明顯觀察到，例如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。  

     (2) 接種觀察----用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。   

     (3) 鏡下觀察----倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。   

2、支原體污染的檢測

     (1) 相差顯微鏡觀察----接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時可見類似于布朗運(yùn)動的表現(xiàn)。
  注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。  

     (2) 熒光染色法觀察----熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。  

     (3) 電鏡檢測----條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。  

     (4) 培養(yǎng)檢測----細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。  

3、病毒的檢測

   (1) 應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動物病毒病  

    (2) 逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)RT_PCR檢測病毒   

（三）污染清除方法

 培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價值不大，宜棄之；在尋找原因后*消毒操作室，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞，再培養(yǎng)。  

 污染細(xì)胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

1.細(xì)菌和真菌的清除

  抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。  

  預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。

2.支原體的清除

   (1)用MRA處理 -----

用MRA（Mycoplasma Removal Agent）處理細(xì)胞，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細(xì)胞純潔健康，效果好。   

   (2)用清洗純化法清除支原體污染的方法 -----

細(xì)胞營養(yǎng)馴化→細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌。

其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低限.

如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。

   (3)藥物輔助加溫處理 ----- 

    先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響。

  (4)使用支原體特異性血清  

用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。

但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。   

（四）污染的預(yù)防

預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度。  

一般預(yù)防可從以下幾方面著手：

1、添加抗生素

2、從物品、用品消毒滅菌著手 -----

    細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。   

3、從操作者做起 -----

     (1)進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手，按規(guī)定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。

     (2)操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。

     (3)操作時要常更換吸管，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

4、防止細(xì)胞交叉污染 -----

     (1)在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分。 

    (2)在進(jìn)行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。   '

    (3)細(xì)胞一旦購置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)。

5、無菌室的*消毒 -----

    (1)0.1%新潔爾滅全面*擦洗無菌室；

   (2)甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細(xì)菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。

   (3)細(xì)胞培養(yǎng)，首先要避免污染，但在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，有了污染用適當(dāng)?shù)姆椒ㄇ宄?，這樣也可以保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功。